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PROUCTS LIST
默瑞生物提供近Novoprotein近岸蛋白質一系列mRNA體外合成酶及試劑,解決mRNA疫苗的關鍵痛點。所有產(chǎn)品均采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn),嚴格控制宿主蛋白質殘留、核酸殘留及常見病原體污染,符合GMP規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質量管理規(guī)程,保障生產(chǎn)過程及所有原輔料可追溯。
產(chǎn)品特點:
*GMP級mRNA體外合成及修飾原料,animal-free,ampicillin-free
*產(chǎn)品生產(chǎn)、質量控制及配套文件體系,符合mRNA疫苗及藥物研發(fā)生產(chǎn)需求
*經(jīng)過臨床使用驗證,單批次產(chǎn)能千萬人份,年產(chǎn)能50億人份
mRNA疫苗的成功需要保證mRNA的穩(wěn)定性和高效翻譯效率以及mRNA的大量生成。
1、生成模板-質粒線性化 相關產(chǎn)品:Bsa I,GMP Grade(貨號:GMP-RE026)
此步將構建好的質粒酶切,處理成線性化雙鏈DNA模板,用于下一步mRNA合成。
限制性內切酶Bsa I 特異性識別雙鏈DNA中位點并進行酶切,可將模板質粒酶切線性化,作為mRNA體外合成模板;
酶切位點:
產(chǎn)品特點:
強特異性
受CpG、Dcm甲基化影響,剪切阻斷
受EcoBI甲基化影響,剪切可能受影響
不受Dam甲基化影響
2、mRNA體外合成
此步以DNA為模板,在體外由RNA聚合酶催化合成mRNA。
T7 RNA Polymerase(T7 RNA聚合酶)是高度特異識別T7啟動子序列的5'→3' RNA聚合酶,以含有T7啟動子序列的單鏈或雙鏈DNA為模板,以NTP為底物,合成與啟動子下游的單鏈DNA互補的RNA。T7 RNA聚合酶是體外轉錄mRNA的關鍵酶。
產(chǎn)品特點:
高度特異識別T7啟動子
20ul反應體系,產(chǎn)量可達150ug
可對低至1ng模板進行有效轉錄
合成長度可達15k
體外轉錄產(chǎn)生的mRNA,Qsep1結果顯示,純度高,均一性好。
3、mRNA轉錄后修飾:加帽加尾
此步對mRNA進行修飾,合成功能完整的mRNA。
完整mRNA結構
3.1、mRNA加帽(Cap0)
此步與3.2同時進行,在mRNA的5'端加上Cap0帽結構,再將Cap0轉化為Cap1結構。
在真核生物中,轉錄后的mRNA必需經(jīng)過一系列修飾才能形成完整的結構,即在5'端形成一個帽子結構(Cap1),3’端形成PolyA尾結構。這些結構與mRNA的穩(wěn)定、轉運和翻譯密切相關。
Vaccinia Capping Enzyme(牛痘病毒加帽酶)用于給體外轉錄合成的mRNA催化加上帽子結構(Cap0),顯著改善mRNA的穩(wěn)定性和翻譯能力,使mRNA可在細胞內表達蛋白,避免核酸外切酶等的降解破壞。
mRNA的帽結構是由一個7-甲基鳥苷通過一個5′–5′三磷酸酯橋連接到mRNA 鏈的5′核苷上組成。Cap-0結構由相鄰的RNA鏈通過三種酶的依次反應形成。進一步形成cap-1結構需要2-O甲基轉移酶(Cat. No: GMP-M072, Novoprotein)參與,該修飾可以降低RNA在體內引起的細胞先天免疫反應。
產(chǎn)品特點:
高效完成mRNA加帽Cap0
提高mRNA的穩(wěn)定性,防止被RNA酶降解
提高mRNA的翻譯效率,提高蛋白產(chǎn)量
3.2、mRNA加帽(Cap1)
此步與3.1同時進行,在mRNA的5'端加上Cap0帽結構,再將Cap0轉化為Cap1結構。
真核生物中,mRNA的轉錄后須經(jīng)系列修飾,在5'端形成一個特殊結構,即帽子結構,3’端形成PolyA尾結構。這些結構與mRNA的穩(wěn)定、轉運和翻譯密切相關。已知Cap1結構存在于所有真核生物mRNA,在穩(wěn)定mRNA結構和提高翻譯效率方面起重要作用。研究表明,體外轉錄修飾得到的Cap1結構mRNA更不容易被免疫系統(tǒng)的RNA感受器(RIG-I)識別,因此免疫刺激更低。
mRNA Cap 2´-O-Methyltransferas (2´-O-甲基轉移酶)可利用 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體, 在 RNA 5´末端緊鄰帽結構(Cap 0)的第一個核苷酸的 2´-O 上添加甲基基團,形成帶有 Cap 1 結構的 mRNA。Cap1 結構能增強 mRNA 的翻譯效率,從而可提高轉染后 mRNA 編碼的蛋白表達水平。該酶只能以帶 7-甲基鳥苷帽結構(m7GpppN)的 RNA 為底物,不會作用于 5´末端為pN、ppN、 pppN 或 GpppN 的 RNA。帶 7-甲基鳥苷帽結構(m7GpppN)的 RNA 可通過 Vaccinia Capping System(Cat. No: GMP-M062, Novoprotein)來制備。
產(chǎn)品特點:
使mRNA的Cap 0帽子甲基化為 Cap 1帽子
提高 RNA 的翻譯效率,提高蛋白產(chǎn)量
進一步降低免疫原性
完整mRNA在細胞內表達GFP蛋白,加帽酶與帽類似物對比
3.3、mRNA加尾(PolyA)
此步在mRNA的3'端加上PolyA尾。
真核生物中,mRNA的轉錄后須經(jīng)系列修飾,在5'端形成一個特殊結構,即帽子結構,3’端形成PolyA尾結構。這些結構與mRNA的穩(wěn)定、轉運和翻譯密切相關。Poly A與成熟mRNA的穩(wěn)定性、翻譯起始以及出核運輸有關,體內轉錄后修飾中,polyA聚合酶在RNA 3’-OH上逐一引入100-200個A堿基。
體外轉錄RNA過程中,E. coli Poly (A) Polymerase(加尾酶) 不依賴模板的存在,可以催化 ATP 以 AMP 的形式依次摻入到 RNA 的 3´末端,即在 RNA 的 3´末端加多聚 A 尾。Poly (A) 聚合酶具有很高的加尾效率,可以在 RNA 的 3´末端加入 20~200 個 A 堿基。 還原體內加尾過程。
產(chǎn)品特點:
穩(wěn)定mRNA的存在形式
引導轉錄終止
提高RNA在真核細胞中的翻譯效率
4、其他相關產(chǎn)品
4.1、防止mRNA降解
在流程2-3 mRNA合成與修飾中加入RNase Inhibitor,防止RNA降解。
RNase Inhibitor可與RNase A形成1:1復合體,對RNase 有*非競爭性抑制,保護mRNA轉錄后不被降解
產(chǎn)品特點:
強抑制RNase活性
穩(wěn)定性強
4.2、降解模板DNA
在流程2 RNA合成結束后,去除模板DNA。
DNase I將單鏈或雙鏈DNA隨機分解。
DNase I 去除RNA樣本種的DNA殘留
4.3、增加mRNA產(chǎn)量
在流程2 RNA合成過程中加入無機焦linsuan酶,增加RNA產(chǎn)量。
無機焦linsuan酶PPase(Pyrophosphatase, Inorganic)可催化無機焦linsuan鹽水解生成正linsuan鹽(P2O7-4+H2O+PPase→2HPO4-2),一方面可去除無機焦linsuan鹽對反應體系的抑制,另一方面為反應提供熱力學動力,促進產(chǎn)物的生成。常用于RNA、DNA、蛋白質的生物合成中,是一種良好的輔劑,在mRNA疫苗體外大規(guī)模合成中加入可顯著提高產(chǎn)量。
無機焦磷酸酶去除mRNA合成過程中產(chǎn)生的焦磷酸,提高mRNA產(chǎn)量
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