影響限制性內(nèi)切酶活性的因素

　　影響限制性內(nèi)切酶活性的因素

　　1、DNA純度

　　在DNA樣品中若含有蛋白質(zhì),或沒有去除干凈制備過程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高濃度金屬離子,均會降低限制酶的催化活性,甚至使限制酶不起作用.

　　2、核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液

　　核酸內(nèi)切限制酶的標準緩沖液包括氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀、Tris-HCL、巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等.

　　使用所有限制酶均可發(fā)揮活性的一種緩沖液.

　　不同限制性內(nèi)切酶對NaCl濃度的要求不同,這是不同限制酶緩沖液組成上的一個主要的不同.據(jù)此可分為高鹽、中鹽和低鹽緩沖液,在進行雙酶解或多酶解時,若這些酶切割可在同種緩沖液中作用良好,則幾種酶可同時酶切；若這些酶所要求的緩沖液有所不同,可采用以下三種方法進行消化反應：先用要求低鹽緩沖液的限制性內(nèi)切酶消化DNA,然后補足適量的NaCl,再用要求高鹽緩沖液的限制酶消化；

　　先用一種酶進行酶解,然后用乙醇沉淀酶解產(chǎn)物,再重懸于另一緩沖液中進行第二次酶解.

　　3、酶切消化反應的溫度

　　DNA消化反應的溫度,是影響限制內(nèi)切酶活性的一個重要因素.不同的核酸內(nèi)切限制酶,具有各自的最適反應溫度.多數(shù)限制內(nèi)切酶的最適反應溫度是37℃,少數(shù)限制性內(nèi)切酶的最適反應溫度高于或低于37℃.

　　4、DNA的分子結(jié)構(gòu)

　　DNA分子構(gòu)型對核酸內(nèi)切限制酶的活性有很大影響,如消化超螺旋的DNA比消化線性DNA用酶量要高出許多倍.

　　有些限制酶在消化它們自己的處于不同部位的限制位點,其效率也有明顯差異.

　　限制性內(nèi)切酶反應的終止 通常是采用65℃條件下溫浴5min；

　　加終止反應液(如0.5mol/L的EDTA使之在溶液中的終濃度達到10 mol/L)螯合Mg2 ,以終止反應.