限制性內(nèi)切酶的一般原則和建議

　　限制性內(nèi)切酶的一般原則和建議

　　DNA中加上酶，然后保溫一段時間就可以了。但是在實(shí)際操作過程中，我們不斷聽到：切不動，裝不上。問題在什么地方？能系列生產(chǎn)限制性內(nèi)切酶的公司國際上，就那么幾個，位列前3的是NEB,Fermentas,SibEnzyme。這些公司提供酶的品質(zhì)一般都能得到保證。您可以懷疑酶的質(zhì)量問題，但是更多的問題來源于模板是否合適酶切要求。下面幾點(diǎn)對你的酶切是有幫助的。

　　1)成功酶切的關(guān)鍵是準(zhǔn)備好模板DNA。DNA樣品中不能含有有機(jī)溶劑（會使酶變性或產(chǎn)生星號貨性），不能含有干擾酶活性的污染物質(zhì)，不能含有高濃度的EDTA(TE中的EDTA濃度較低，對Mg的濃度影響較小)；同時要對DNA甲基化程度及其對酶切效率的影響要做到心中有數(shù)。

　　2)選用合適的酶。根據(jù)酶切序列選用，特別注意選用甲基化對酶活性的干擾。

　　3)正確使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低溫環(huán)境中，只是在需要用酶才從冰箱中取出來。運(yùn)輸和臨時存放時需要將酶至于冰上。手拿酶管時不要接觸酶管下步含酶的部分，移酶時盡可能用長TIP,避免污染。用完后需要及時送回原處。注意：酶通常是最后加。

　　4)反應(yīng)體積需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?，常?guī)的酶切一般要維持在10-50ul，酶切鑒定10-20ul就可以了。

　　5)模板濃度問題：濃度過高，溶液黏度過大，酶不能有效擴(kuò)散，酶切效果不會好。濃度過低，也會影響酶活性。

　　6)注意模板用量和反應(yīng)體積的關(guān)系。對酶用量，模板用量，反應(yīng)體積等要素的確定需要的是時間和經(jīng)驗(yàn)的積累。

　　7)酶切反應(yīng)的各個組分加完后，需要用TIP小心混勻幾次，shortspin一下就可以保溫了。一般不能使用振蕩器混勻。

　　8)反應(yīng)溫度的選擇。一般反應(yīng)都用37度，但是SmaI的適合溫度是25度，37度時酶仍表現(xiàn)出活性，但是效率下降50%。部分從耐熱菌制備的酶需要在37度以上的溫度反應(yīng)，如TaqI的最適溫度為65度，37度保溫，效率僅為前者的1/10。

　　9)反應(yīng)時間的選擇。一般酶切鑒定30分鐘就可以了。要*酶切可以采用少量的酶長時間反應(yīng)，或較高的酶量短時間處理都可以達(dá)到。在使用高酶量的時候需要注意甘油的最終濃度不要超過5%，也就是說10ul的體系，酶的用量不要超過1ul。

　　10)是否和如何終止反應(yīng)？酶切鑒定之類的實(shí)驗(yàn)不需要特殊處理。滅活的手段：加入高濃度的EDTA；65度或80度熱處理20-30分鐘；部分從高溫菌純化出來的內(nèi)切酶由于最適的反應(yīng)溫度比較高，熱處理滅活不一定*，需要用苯酚/氯仿/乙醇方法純化；電泳回收也是實(shí)驗(yàn)室常用除酶的手段。